脂肪血管基质成分复合骨软骨一体化支架的体外(2)

1.4.2 脂肪来源血管基质成分的分离与鉴定 无菌条件下获取兔双侧腹股沟脂肪组织，PBS 中清洗3 次，彻底去除红细胞与组织碎片。加入预热的0.1%Ⅰ型胶原酶溶液，置37 ℃水浴震荡消化1 h。300×g离心5 min，去除上层脂肪细胞与胶原酶溶液。加入适量含10%牛血清白蛋白的DMEM 重悬细胞，经400 μm 细胞筛过滤，获得血管基质成分细胞进行计数。将血管基质成分置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中，以含体积分数10%胎牛血清的DMEM 培养48 h 后换液，去除未贴壁细胞及残留的红细胞，当细胞集落达到80%汇合后用胰蛋白酶消化细胞，这些细胞被称为脂肪间充质干细胞的P1。

将脂肪来源血管基质成分经培养后的原代细胞经Trypsin消化后调整细胞浓度为109L-1，与FITC 和PE 标记的抗体冰上避光孵育30 min，用含1%牛血清白蛋白的PBS 重悬细胞，流式细胞术分析其表面特异性抗原的表达情况。

使用脂肪来源血管基质成分经培养后的原代细胞进行诱导分化，分别添加成脂诱导培养基(10-6mol/L 地塞米松、10 mg/L 胰岛素和0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)、成骨(0.1 μmol/L 地塞米松、10 mmol/L β- 甘油磷酸钠和50 μmol/L 抗坏血酸磷酸盐)和成软骨(6.25 mg/L 胰岛素、10 μg/L 转化生长因子β 和50 μg/L 抗坏血酸)诱导培养基，观察其形态变化，并对诱导分化后的细胞分别进行油红O染色、茜素红染色与阿利新蓝染色。

1.4.3 脂肪来源血管基质成分与骨软骨一体化支架共培养使用前期研究中含转化生长因子β3 的P3 代脂肪间充质干细胞作为软骨诱导组和含体积分数10%胎牛血清的P3 代脂肪间充质干细胞作为对照组[14]。脂肪来源血管基质成分(实验组)、含转化生长因子β3 的脂肪间充质干细胞和含体积分数10%胎牛血清的脂肪间充质干细胞分别接种于含骨软骨一体化支架的96 孔板内，即在骨软骨一体化支架表面缓慢滴加0.2 mL 细胞悬浮液，至完全覆盖支架，每个支架接种2×105个细胞，放在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。

1.4.4 复合培养后的细胞增殖检测 复合培养1，3，5，7，9，11 d 后，每孔加入CCK8 孵育4 h，测定450 nm 处的吸光度值。复合培养7 d 后，取出3 组复合物，置于甲醇和丙酮等体积混合固定液中室温固定 10 min，PBS 洗2 次，用刀片将膜割下，采用含1 mg/L DAPI、50%甘油的PBS染色，荧光显微镜下拍照。

1.4.5 复合培养后的细胞软骨相关基因检测 复合培养21 d后，通过TRIzol 法提取总RNA，根据试剂盒说明书进行反转录和Real time-PCR 反应，反应条件：95 ℃10 min，95 ℃15 s，55 ℃1 min，40 个循环，72 ℃延伸1 min。检测相关目的基因，以GAPDH 为内参基因，各引物序列见表1，采用ΔΔCt 法计算各组基因相对表达量。

表1 ｜PCR 引物序列Table 1 ｜Primer sequence for PCR基因序列 正义链 反义链Sox9 TTC AGC AGC CAA TAA GTG GTG GAAT GTC TTG AAG GTT AⅡ型胶原 AAG TCC CTC AAC AAC CAG AT CCA GTA GTC TCC ACT CTT CCA蛋白聚糖 CAG CAC CAC CAA TGT AAG CCT CCA CGA ACT CAG AAG GAPDH GCA TCC ACG AAA CTA CCT TC TCA GCT CAG GCA GGA AAG AC

1.4.6 复合培养后的细胞糖胺多糖含量检测 复合培7，14，21 d 后，将组织消化液 50 μL 加入96 孔板，另外加入200 μL预先配置好的二甲基亚甲基蓝比色染色液。利用二甲基亚甲基蓝比色法测定糖胺多糖的含量，实验步骤依据二甲基亚甲基蓝比色法测定糖胺多糖总含量定量检测试剂盒说明书进行。

1.5 主要观察指标 各组细胞增殖、软骨相关基因表达与糖胺多糖总含量。

1.6 统计学分析 各组所得计量数据以±s表示，用SPSS 10.0 进行统计学分析，两组间均数比较用t检验。检验水准α=0.05，P＜ 0.05 为差异有显著性意义。

2 结果 Results

2.1 脂肪来源血管基质成分的细胞培养和鉴定 脂肪来源血管基质成分细胞接种24 h 后，细胞培养皿中大多数细胞呈现梭形，且处于分裂期；48-72 h 后细胞增殖明显增多，细胞集落数量明显增多(图1)。

流式细胞仪检测结果显示，脂肪来源血管基质成分分离培养的细胞表型呈CD44+、CD105+、CD90+、CD14-、CD19-、CD45-，见图2。脂肪来源的血管基质成分经成脂诱导28 d 后，油红O 染色显示大量红染的脂质沉淀；经成骨诱导21 d 后，茜素红染色结果显示有大量红染的钙结节形成；经成软骨诱导14 d 后，阿尔新蓝染色可见呈阳性，表明有软骨细胞外基质成分产生(图3)。

2.2 复合培养细胞增殖检测结果 CCK8实验结果显示，随着培养时间的延长，3 组细胞数量增加，实验组复合培养7，9，11 d 的细胞数量多于与其他两组(P＜ 0.05)，见图4A。这表明脂肪来源血管基质成分在骨软骨一体化支架中的细胞增殖能力强。

文章来源：《冶金与材料》 网址: http://www.yjyclzz.cn/qikandaodu/2021/0203/733.html