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脂肪血管基质成分复合骨软骨一体化支架的体外(3)
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摘要：复合培养7 d 后的荧光显微镜下可见，实验组蓝光细胞多于其他两组，见图4B。结果提示脂肪来源血管基质成分与骨软骨一体化支架具有良好的生物相容性。
复合培养7 d 后的荧光显微镜下可见，实验组蓝光细胞多于其他两组，见图4B。结果提示脂肪来源血管基质成分与骨软骨一体化支架具有良好的生物相容性。
图 1 ｜ 脂肪来源血管基质成分形态学观察(倒置相差显微镜，×40)Figure 1 ｜Morphology observation of the adipose-derived stromal vascular fraction (inverted phase contrast microscope, ×40)图注：A 为接种24 h，大多数细胞呈现梭形，且处于分裂期；B，C 为接种48，72 h，细胞增殖明显增多，细胞集落数量明显增多
图 2 ｜ 流式细胞仪检测兔脂肪来源血管基质成分表面特异性蛋白Figure 2 ｜Specific protein on the cells from rabbit adipose-derived stromal vascular fraction detected by flow cytometry图注：脂肪来源血管基质成分分离培养的细胞表型呈CD44+、CD105+、CD90+、CD14-、CD19-、CD45-
图 3 ｜ 脂肪来源血管基质成分的多向诱导分化Figure 3 ｜ Multiple induced differentiation of adipose-derived stromal vascular fraction图注：图A 为成脂诱导28 d，油红O 染色观察到脂质滴；B 为成骨诱导21 d，茜素红染色观察到钙沉积；C 为软骨诱导14 d，阿利辛蓝染色观察到软骨特异性基质
图 4 ｜ 脂肪来源血管基质成分与骨软骨一体化支架的生物相容性Figure 4 ｜Biocompatibility of cells on osteochondral integrated scaffold combined with adiposederived stromal vascular fraction图注：A 为CCK8 法检测细胞增殖情况，实验组复合培养7，9，11 d 的细胞数量多于与其他两组(P＜ 0.05)；B 为复合培养7 d 的DAPI 染色荧光显微镜下观察，实验组蓝光细胞多于其他两组
2.3 复合培养细胞软骨相关基因表达检测结果 复合培养21 d 后，实验组的Sox9、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA 相对表达量高于其他两组(P＜ 0.05)，并且软骨诱导组Sox9、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA相对表达量高于对照组(P＜ 0.05)，见图5。
2.4 复合培养细胞糖胺多糖含量检测结果 实验组复合培养7，14，21 d 的糖胺多糖含量高于其他两组(P＜ 0.05)，软骨诱导组复合培养7，14，21 d 的糖胺多糖含量高于对照组(P＜ 0.05)，见图6。
3 讨论 Discussion
关节软骨无血管、无淋巴管、无神经组织的结构特点使其再生能力十分有限，一旦受损其难以自我修复。目前已被用于关节软骨缺损的治疗方法包括微骨折术、自体软骨细胞移植、人工关节置换等，这些治疗方法可暂时改善其临床症状，但长期修复效果不佳。近年来，组织工程学的发展为软骨缺损修复提供了新的治疗策略，其中以干细胞为基础的组织工程方法为软骨缺损修复开辟了一条全新的途径[15-25]，而拥有足够数量、功能正常、具有成软骨分化能力的种子细胞尤为重要。血管基质成分是脂肪组织通过胶原酶消化、过滤、离心除去成熟脂肪细胞后得到混杂的细胞群体。与其他的自体干细胞(比如与脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞等)相比，脂肪来源血管基质成分具有如下优势：第一，虽然在免疫调节、血管发生和抗炎等特征方面相似，异质细胞组成的脂肪来源血管基质成分可能在动物实验中有更好的疗效[26-30]；第二，脂肪来源血管基质成分获得更容易，不需要体外细胞分离和培养，因而可以通过一次手术广泛应用临床[31-35]。
图 5 ｜ 脂肪来源的血管基质成分复合骨软骨一体化支架的软骨分化相关基因检测Figure 5 ｜Detection of genes related to osteochondral integrated scaffold combined with adipose-derived stromal vascular fraction图注：与对照组比较，aP＜ 0.05；与软骨诱导组比较，bP＜ 0.05
图 6 ｜ 脂肪来源血管基质成分复合骨软骨一体化支架的糖胺多糖含量检测Figure 6 ｜Detection of glycosaminoglycan content of osteochondral integrated scaffold combined with adipose-derived stromal vascular fraction图注：与对照组比较，aP＜ 0.05；与软骨诱导组比较，bP＜ 0.05
实验首先从雌兔双侧腹股沟脂肪组织分离血管基质成分，进一步以干细胞诱导多向分化能力作为金标准鉴定。通过与含转化生长因子β3 的脂肪间充质干细胞和含体积分数10%胎牛血清的脂肪间充质干细胞相比，证实脂肪来源血管基质成分在骨软骨一体化支架上的增殖快速。很多体内外实验证实，旁分泌在脂肪来源血管基质成分的促血管化作用中扮演了重要角色。转化生长因子β3 是转化生长因子家族的主要成员之一，可促进脂肪干细胞的增殖分化、促进细胞外基质形成，尤其在软骨细胞生长中发挥关键的作用[36-40]。DAPI 染色显示，血管基质成分复合一体化支架组的细胞增殖明显，细胞数量高于软骨诱导组；另外，与软骨诱导组和对照组相比，实验组软骨表达相关基因和糖胺多糖含量增高。对于潜在的临床应用，含转化生长因子β3 的脂肪间充质干细胞和体积分数10%胎牛血清的脂肪间充质干细胞存在两个方面的污染风险：其一为外源性物质在制备过程中可能发生的外源性污染；其二是添加试剂为外源蛋白，其本身生物污染不可小觑。另外，脂肪间充质干细胞的贴壁培养和纯化需要专业实验室设备和丰富经验操作人员，这限制了脂肪间充质干细胞在临床上的进一步应用[34-38]。实验显示，兔脂肪来源血管基质成分与骨软骨一体化支架具有良好的生物相容性，证实了自体血管基质成分复合骨软骨一体化支架修复关节软骨缺损的可行性方法，为软骨组织工程的临床应用提供了新的策略。
文章来源：《冶金与材料》 网址: http://www.yjyclzz.cn/qikandaodu/2021/0203/733.html