构建预血管化细胞膜片及血管形成相关因子的表(2)

1.4.2 流式细胞术检测BMSCs 表面标志物 收集传代至第2代的BMSCs，用PBS 重悬细胞并计数，分装至EP 管，分别加入抗体(CD90、CD44、CD34、 CD45)，混匀，室温孵育30-60 min，1 500 r/min 离心10 min，去上清，PBS 洗涤2次。1 500 r/min 离心10 min，去上清，PBS 洗涤2 次。加入200 μL 的PBS 混匀细胞，上机检测。

1.4.3 BMSCs 多向分化能力鉴定

成骨诱导：按照protocol 配制兔BMSCs 成骨诱导分化培养基。收集 P2 代BMSCs，完全培养基重悬细胞并计数；按照2×104/cm2的细胞密度均匀种植在预先用0.1%明胶覆盖的6 孔板中；放入37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，当细胞融合达60%-70%时弃完全培养基，诱导组加入2 mL 成骨诱导培养基，未诱导继续使用完全培养基培养。以后每3 d 更换一次培养基，视诱导组细胞形态及生长情况进行茜素红染色。

成脂诱导：按照protocol 配制BMSCs 成脂诱导分化培养基，分为A 液和B 液。收集 P2 代BMSCs，完全培养基重悬细胞并计数；按照2×104/cm2的细胞密度均匀种植于6 孔板中；放入37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，当细胞融合达100%时，诱导组弃完全培养基，加入2 mL A 液诱导3 d，吸走A 液换成B 液，24 h 后吸走B 液，换A 液；A 液和B 液交换作用3-5 次后继续用B 液维持培养4-7 d，每3 d更换一次培养基。未诱导组继续使用完全培养基培养。至实验组脂滴变得足够大、圆，进行油红O 染色观察。

1.4.4 制备干细胞膜片及鉴定

制备干细胞膜片：将P2 代BMSCs 按照9×104/cm2密度种入6 孔板中，待细胞密度达100%时去掉原培养基，干细胞膜片组加入等量的培养基(含体积分数10%胎牛血清、a-MEM 培养基、1%三抗、50 mg/L 抗坏血酸)，对照组用不含抗坏血酸的培养基(含体积分数10%胎牛血清、a-MEM 培养基、1%三抗)，每3 d 更换一次培养基，干预14 d。每天光镜下观察细胞形态变化。

苏木精-伊红染色：干预14 d，干细胞膜片经固定、制备成石蜡切片，进行苏木精-伊红染色：脱蜡、苏木精染核、盐酸分化、脱水Ⅰ、伊红复染、脱水Ⅱ、透明、封固。

多向分化能力鉴定：将干预14 d 的干细胞膜片进行成骨、成脂诱导分化，对照组使用兔BMSCs 完全培养基培养，分别进行西素红染色、油红O 染色。

细胞外基质相关因子mRNA 表达：①总RNA 提取：获得干预14 d 干细胞膜片组、对照组标本，PBS 漂洗2 次，加入1 mL Trizol，静置5 min，移入1.5 mL EP 管，静置5 min；加入200 μL 氯仿，静置10 min，4 ℃12 000 ×g离心15 min；取上清，加入500 μL 异丙醇，静置10 min，4 ℃12 000×g离心15 min；弃上清，加入1 mL 体积分数75%乙醇，轻轻洗涤沉淀，4 ℃7 500 ×g离心5 min；弃上清，晾干，加入20 μL DEPC水溶解RNA，部分用于总RNA 定量，其余RNA 溶液于-80 ℃保存备用。②配制反转录反应体系(20 μL 体系)，5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)4 μL，总RNA 1 000 ng，RNase Free dH2O Up to 20 μL，在冰上进行。③反转录反应条件：按照试剂盒的说明进行反转录反应。37 ℃15 min(反转录反应)→85 ℃5 s(反转录酶的失活反应)→4 ℃。上机结束后将所得c-DNA 分装，-20 ℃保存备用。④RT-PCR 反应：反转录获得的cDNA，利用RT-PCR 检测Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白mRNA表达。引物序列由TaKaRa公司协助设计合成，引物序列(5’→3’)。GAPDH F：TGA CGA CAT CAA GAA GGT GGT G，GAPDH R：GAA GGT GGA GGA GTG GGT GTC；Ⅰ型胶原F：TTC TAT TGG TCC CGT CGG T，Ⅰ型胶原R：GCT GAG TCT CAG GTC GCG；纤维连接蛋白F：ACC ATA CCT GCC GAA TGT AGA TGA，纤维连接蛋白R：CAA CCT CCT CCC GCA CTT TGT GCC。配制25 μL RT-PCR 反应体系(SYBR@ Premix Ex Taq II 12.5 μL，引物1 μL，cDNA 2 μL，RNase Free dH2O 9.5 μL)。RT-PCR 反应条件：Step1(预变性)，95 ℃30 s；Step2(PCR 反应)，95 ℃5 s，60 ℃30 s(40 次循环)；Step3(Melt Curve)，95 ℃10 s，65-95 ℃，每5 s 增加0.5 ℃。⑤数据分析：实验组、对照组样本测定3 个基因测定值，得到3 个Ct 值，GAPDH 管家基因，利用GAPDH 对目的样本基因拷贝数进行校正，以排除原始样本量差异对实验结果的影响。计算出Ct 值的平均值，根据以下公式进行计算：?Ct=Ct目的基因-Ct 内参基因，??Ct=?Ct 实验样本-?Ct 对照样本，实验组目的基因相对表达量=2-??Ct。

1.4.5 构建预血管化细胞膜片 用UVECs 培养基培养兔UVECs，每3 d 更换一次培养基，传至P2 代进行干预，每天镜下观察细胞形态变化。获取干预14 d 的干细胞膜片，弃抗坏血酸培养基，PBS 洗涤。实验组在干细胞膜片上加入P2代UVECs 共培养，种植密度为5×104/cm2，用兔UVECs 培养基进行培养；对照组为P2 代UVECs 单独培养，种植密度为5×104/cm2，用兔UVECs 培养基进行培养。每2 d 更换一次培养基，干预14 d，每天镜下观察细胞形态及大体改变。

文章来源：《冶金与材料》 网址: http://www.yjyclzz.cn/qikandaodu/2021/0203/732.html