构建预血管化细胞膜片及血管形成相关因子的表(3)

1.4.6 预血管化细胞膜片苏木精-伊红染色 将干预3，7，14 d 的实验组、对照组细胞经PBS 漂洗，进行苏木精-伊红染色。

1.4.7 预血管化细胞膜片CD31 免疫组化染色 收集干预14 d的实验组、对照组细胞进行固定，细胞通透、封闭非特异性蛋白，加入鼠抗兔CD31 一抗工作液，4 ℃孵育过夜，次日倒掉一抗工作液，滴加羊抗鼠IgG 二抗工作液，室温孵育30 min，DAB 显色，复染，脱水，透明，封固。

1.4.8 预血管化细胞膜片RT-PCR 检测 获得干预3，7，14 d的实验组、对照组细胞，进行细胞总RNA 提取，反转录成cDNA，RT-PCR 检测血管形成相关因子mRNA 表达。

PCR 引物：根据NCBI GenBank 中兔GADPH、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管生成素1、血管生成素2设计相应的引物核酸序列，见表1。操作步骤如1.4.4。

表1 ｜血管形成相关基因引物序列Table 1 ｜Primer sequence of angiogenesis-related genes表注：上述引物由TaKaRa 公司协助设计合成，GAPDH 为内参；所有引物使用时短暂离心，加入无核酶水稀释至终浓度为10 μmol/L，4 ℃保存备用引物名称 碱基序列(5’→3’) 长度(bp)GAPDH forward TGA CGA CAT CAA GAA GGT GGT G 121 GAPDH reverse GAA GGT GGA GGA GTG GGT GTC血管内皮生长因子 forward GCA ATG ATG AAA GCC TGG AGT G 188血管内皮生长因子reverse CTT GCC CTT TCC TCG AAC TGA T碱性成纤维细胞生长因子forward GAG AAG AGC GACC CAC ACA TC 118碱性成纤维细胞生长因子reverse CCA GCA GTC TTC CAT CTT CCT T血管生成素1 forward TGT GCC CTC ATG CTT ACA GG 101血管生成素1 reverse TTC AGT TTG CCG TGG TTT TG血管生成素2 forward TAA GAG ACT GGG AAG GGA ATG AAG 131血管生成素2 reverse TTG GCT GAT GCT GCT TAT TTT G

1.5 主要观察指标 预血管化细胞膜片镜下改变、组织学改变、免疫组化染色及血管形成相关因子表达水平。

1.6 统计学分析 用SPSS 22.0 软件进行数据分析，实验数据采用±s方式表示，两组数据之间的比较采用独立样本t检验，P＜ 0.05 表示数据有显著性意义。

2 结果 Results

2.1 BMSCs 的形态及鉴定 细胞贴壁生长，呈梭形、纺锤形，平行排列或旋涡状生长，见图1。BMSCs 表面高表达CD90(97.80%)、CD44(95.27)%， 低 表 达CD34(1.01%)、CD45(0.90%)，见图2，符合间充质干细胞免疫表型。经成骨细胞诱导，茜素红染色可见钙颗粒染成红色，见图3A；未经诱导的细胞染色结果为阴性，见图3B。成脂肪细胞诱导，油红O 染色可见脂滴染成红色，见图3C；未经诱导的细胞染色结果为阴性，见图3D。由此可知，经全骨髓贴壁法分离培养的细胞具有贴壁特性，符合间充质干细胞免疫表型，具有多向分化潜能，符合间充质干细胞特征表现。

2.2 干细胞膜片镜下观 经抗坏血酸作用后BMSCs 密度不断增加，细胞间隙不明，细胞呈梭状，重叠生长细胞密度不断增加，培养14 d 后细胞密度进一步扩大，细胞间隙消失、重叠生长，形态难以辨认，使用无菌镊机械分离细胞膜片，细胞膜片能够与培养皿底部完全分离，大体观察为半透明膜状细胞膜片；无抗坏血酸干预的BMSCs 增殖速度相对慢，细胞密度达到100%时细胞出现接触抑制现象，培养14 d 未见膜片样结构形成，见图4。

2.3 干细胞膜片多向分化能力鉴定 干细胞膜片经成骨诱导分化培养基，培养过程中光镜下观察可见钙颗粒析出，经茜素红染液染色可见钙颗粒染成红色；未经诱导的细胞膜片细胞形态未见明显变化，茜素红染色阴性。细胞膜片经成脂诱导分化培养基干预，培养过程中倒置显微镜下观察可见胞浆内脂滴不断增大、变圆，油红O 染液染色可见脂滴染成红色；未经诱导分化的细胞膜片细胞形态未经明显改变，油红O 染色阴性，见图5。由此可见，BMSCs 经抗坏血酸处理形成细胞膜片后仍保留分化能力。

2.4 干细胞膜片细胞外基质相关检测 苏木精-伊红染色显示，干细胞膜片中的BMSCs 呈复层生长，细胞之间紧密连接，并分泌丰富的细胞外基质，见图6A。干细胞膜片组BMSCs Ⅰ型胶原及纤维连接蛋白mRNA 表达高于对照组(P＜0.05)，见图6B。

2.5 兔UVECs 镜下观 兔UVECs P0 代细胞贴壁生长，细胞为多角形，单层，当细胞汇合、融合时排列呈“铺路石”样，当细胞密度达约80%时按照1 ∶3 比例进行传代培养，传代细胞约30 min 开始贴壁，细胞呈集落生长，形态未见明显改变，增殖速度快，约2 d 即可进行传代，见图7。

2.6 预血管化细胞膜片形态学观察 UVECs 与干细胞膜片共培养，UVECs 能够贴附于膜片上生长，每天镜下观察可看见细胞变化，3 d 后可见细胞发生迁移、重排，7 d 后可见脐静脉内皮细胞之间发生“联系”，形成网状结构，14 d 网状结构更加明显；UVECs 单独培养，细胞密度不断增加，形成细胞团，未见细胞发生重排、迁移形成网状结构，见图8。

文章来源：《冶金与材料》 网址: http://www.yjyclzz.cn/qikandaodu/2021/0203/732.html