构建预血管化细胞膜片及血管形成相关因子的表(7)

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0 引言 Introduction20 世纪90 年代， LANGER 和VACANTI 提出的组织工程概念为器官移植提供了潜在无限的自体组织供应[1-3]。经过多年的努力，组织工程技术取得了很大进步，逐步进入临床应用研究，但移植早期未能得到足够的血液供应，是目前组织工程组织移植失败的重要因素之一。工程组织难以实现血管化成为制约其临床应用的关键因素。血管化是组织移植后在宿主体内存活且维持功能的关键[4]。研究者们提出许多策略试图解决此问题，主要包括添加种子细胞，如内皮细胞、内皮祖细胞等可分泌血管内皮生长因子的细胞；添加血管生成相关因子，如血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子[5-10]；改进支架材料，如改造天然支架、3D 打印技术设计的新型支架等[11-12]。虽然这些研究取得了一定的进展，但其形成的血管网络不稳定，影响了移植物的存活。预血管化策略成为了组织工程血管化研究热点，使用细胞膜片技术构建预血管化组织是研究热点之一。细胞膜片技术由日本学者OKANO 等[13-14]发明，该项技术具备许多优势，可以免去因使用胰蛋白酶消化给细胞带来伤害的过程，保留细胞外基质等结构[15]，而且在维持细胞良好功能及提高细胞利用率中具有绝对优势[16-17]。利用自体细胞构建细胞膜片已被应用于多项组织工程，包括食管、角膜、心脏、牙周韧带等[18-21]。SHIMIZU 等[22]发现，如果叠加细胞膜片的层数超过3 层其上层的膜片将会死亡。有学者发现细胞膜片共培养体系有利于工程化组织在体外形成内皮血管网络。ASAKAWA 等[23]尝试将人真皮成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞(umbilical vein endothelial cells，UVECs) 及二者共培养形成细胞膜片，分别以不同形式、不同顺序叠加构建成3 层结构，结果显示所在的3 层结构中都能形成血管网。SASAGAWA 等[24]在成肌细胞膜片上种植人UVECs，发现在体外人UVECs 能形成血管化网络结构；接下来又将该膜片复合内皮细胞构建成“三明治”结构，发现内皮细胞能在各层膜片间形成连接且形成血管网络，进一步植入体内后的结果显示，移植物中出现新的血管网，并且与宿主血管形成吻合构成具有功能的血管网络。目前已知细胞膜片与内皮细胞共培养能在体外形成血管网络，植入体内能够加快组织工程化组织血管化进程。干细胞膜片为UVECs 的增殖、迁移、重排和血管形成提供了适宜微环境[25-26]，但是预血管化细胞膜片在血管化过程中如何发挥作用尚不清楚。众所周知，在新生血管形成过程中细胞因子调控发挥着重要作用，如血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等血管形成相关因子，其增高可促进UVECs 的迁移、增殖和血管形成[27-28]。实验在体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，经抗坏血酸作用制备干细胞膜片，加入UVECs 共培养构建预血管化细胞膜片，探索干细胞膜片与兔UVECs 共培养形成血管网络过程中血管形成相关因子基因表达变化，为进一步探究预血管化细胞膜片体外血管网络形成的作用机制提供理论基础，为预血管化细胞膜片应用于组织工程血管化领域提供理论基础。1 材料和方法 Materials and 设计 体外细胞学观察实验 时间及地点 实验于2019 年1 至10 月在广东省人民医院医学研究中心实验室完成 材料1.3.1 实验动物 普通级雄性新西兰大白兔4 只，约1 月龄，体质量1.0-1.5 kg，购自南方医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2011-0015。所有动物实验均按照广东省人民医院(广东省医学科学院)医学伦理研究委员会的要求操作(粤医科伦理A ) 主要细胞与试剂 兔UVECs(普诺赛，武汉，CP-Rb036)；兔BMSCs 完全培养基、兔BMSCs 成脂诱导分化培养基、兔BMSCs 成骨诱导分化培养基(Cyagen，USA)；兔UVECs 专用培养基(普诺赛，武汉)；0.25%胰酶-EDTA、a-MEM 培养基、澳洲胎牛血清(Gibco，USA)；青霉素-链霉素-两性霉素B 混合溶液(三抗)、抗坏血酸、二甲基亚砜DMSO(Sigma， USA)；苏木精染液、番红染液、伊红染液、Masson 丽春红酸性染液(谷歌生物公司)；鼠抗兔CD90、鼠抗兔CD44、鼠抗兔CD45、鼠抗兔CD34(Invitrogen，USA)；鼠抗兔CD31 一抗(Novus，USA)；羊抗鼠 IgG 二 抗 (ThermoFisher，USA)；RNAiso Plus RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒(RR036A)、荧光定量试剂盒(DRR420A)(TaKaRa，Japan) 实验方法1.4.1 兔BMSCs 的分离培养 使用全骨髓贴壁方法体外分离、培养兔BMSCs。空气栓塞法处死兔子，置于超净工作台内；消毒兔子腹部及下肢，逐层分离下肢皮肤、肌肉，暴露股骨；分离股骨，剔除肌肉、筋膜等多余组织；使用咬骨钳咬断股骨远端，使用a-MEM 培养基冲洗骨髓腔；使用200 目过滤网过滤骨髓腔，收集过滤液放入15 mL离心管内，常规离心(常温，1 000 r/min 离心5 min)；弃上清，加入兔BMSCs 完全培养基，重悬细胞，转移至T25 培养瓶；将培养瓶置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内培养；3 d 后首次换液，保留贴壁细胞，随后每3 d 更换培养基；镜下观察细胞形态及生长变化，至细胞生长至覆盖培养面80%左右时进行冻存或传代 流式细胞术检测BMSCs 表面标志物 收集传代至第2代的BMSCs，用PBS 重悬细胞并计数，分装至EP 管，分别加入抗体(CD90、CD44、CD34、 CD45)，混匀，室温孵育30-60 min，1 500 r/min 离心10 min，去上清，PBS 洗涤2次。1 500 r/min 离心10 min，去上清，PBS 洗涤2 次。加入200 μL 的PBS 混匀细胞，上机检测 BMSCs 多向分化能力鉴定成骨诱导：按照protocol 配制兔BMSCs 成骨诱导分化培养基。收集 P2 代BMSCs，完全培养基重悬细胞并计数；按照2×104/cm2的细胞密度均匀种植在预先用0.1%明胶覆盖的6 孔板中；放入37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，当细胞融合达60%-70%时弃完全培养基，诱导组加入2 mL 成骨诱导培养基，未诱导继续使用完全培养基培养。以后每3 d 更换一次培养基，视诱导组细胞形态及生长情况进行茜素红染色。成脂诱导：按照protocol 配制BMSCs 成脂诱导分化培养基，分为A 液和B 液。收集 P2 代BMSCs，完全培养基重悬细胞并计数；按照2×104/cm2的细胞密度均匀种植于6 孔板中；放入37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，当细胞融合达100%时，诱导组弃完全培养基，加入2 mL A 液诱导3 d，吸走A 液换成B 液，24 h 后吸走B 液，换A 液；A 液和B 液交换作用3-5 次后继续用B 液维持培养4-7 d，每3 d更换一次培养基。未诱导组继续使用完全培养基培养。至实验组脂滴变得足够大、圆，进行油红O 染色观察 制备干细胞膜片及鉴定制备干细胞膜片：将P2 代BMSCs 按照9×104/cm2密度种入6 孔板中，待细胞密度达100%时去掉原培养基，干细胞膜片组加入等量的培养基(含体积分数10%胎牛血清、a-MEM 培养基、1%三抗、50 mg/L 抗坏血酸)，对照组用不含抗坏血酸的培养基(含体积分数10%胎牛血清、a-MEM 培养基、1%三抗)，每3 d 更换一次培养基，干预14 d。每天光镜下观察细胞形态变化。苏木精-伊红染色：干预14 d，干细胞膜片经固定、制备成石蜡切片，进行苏木精-伊红染色：脱蜡、苏木精染核、盐酸分化、脱水Ⅰ、伊红复染、脱水Ⅱ、透明、封固。多向分化能力鉴定：将干预14 d 的干细胞膜片进行成骨、成脂诱导分化，对照组使用兔BMSCs 完全培养基培养，分别进行西素红染色、油红O 染色。细胞外基质相关因子mRNA 表达：①总RNA 提取：获得干预14 d 干细胞膜片组、对照组标本，PBS 漂洗2 次，加入1 mL Trizol，静置5 min，移入1.5 mL EP 管，静置5 min；加入200 μL 氯仿，静置10 min，4 ℃12 000 ×g离心15 min；取上清，加入500 μL 异丙醇，静置10 min，4 ℃12 000×g离心15 min；弃上清，加入1 mL 体积分数75%乙醇，轻轻洗涤沉淀，4 ℃7 500 ×g离心5 min；弃上清，晾干，加入20 μL DEPC水溶解RNA，部分用于总RNA 定量，其余RNA 溶液于-80 ℃保存备用。②配制反转录反应体系(20 μL 体系)，5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)4 μL，总RNA 1 000 ng，RNase Free dH2O Up to 20 μL，在冰上进行。③反转录反应条件：按照试剂盒的说明进行反转录反应。37 ℃15 min(反转录反应)→85 ℃5 s(反转录酶的失活反应)→4 ℃。上机结束后将所得c-DNA 分装，-20 ℃保存备用。④RT-PCR 反应：反转录获得的cDNA，利用RT-PCR 检测Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白mRNA表达。引物序列由TaKaRa公司协助设计合成，引物序列(5’→3’)。GAPDH F：TGA CGA CAT CAA GAA GGT GGT G，GAPDH R：GAA GGT GGA GGA GTG GGT GTC；Ⅰ型胶原F：TTC TAT TGG TCC CGT CGG T，Ⅰ型胶原R：GCT GAG TCT CAG GTC GCG；纤维连接蛋白F：ACC ATA CCT GCC GAA TGT AGA TGA，纤维连接蛋白R：CAA CCT CCT CCC GCA CTT TGT GCC。配制25 μL RT-PCR 反应体系(SYBR@ Premix Ex Taq II 12.5 μL，引物1 μL，cDNA 2 μL，RNase Free dH2O 9.5 μL)。RT-PCR 反应条件：Step1(预变性)，95 ℃30 s；Step2(PCR 反应)，95 ℃5 s，60 ℃30 s(40 次循环)；Step3(Melt Curve)，95 ℃10 s，65-95 ℃，每5 s 增加0.5 ℃。⑤数据分析：实验组、对照组样本测定3 个基因测定值，得到3 个Ct 值，GAPDH 管家基因，利用GAPDH 对目的样本基因拷贝数进行校正，以排除原始样本量差异对实验结果的影响。计算出Ct 值的平均值，根据以下公式进行计算：?Ct=Ct目的基因-Ct 内参基因，??Ct=?Ct 实验样本-?Ct 对照样本，实验组目的基因相对表达量=2-?? 构建预血管化细胞膜片 用UVECs 培养基培养兔UVECs，每3 d 更换一次培养基，传至P2 代进行干预，每天镜下观察细胞形态变化。获取干预14 d 的干细胞膜片，弃抗坏血酸培养基，PBS 洗涤。实验组在干细胞膜片上加入P2代UVECs 共培养，种植密度为5×104/cm2，用兔UVECs 培养基进行培养；对照组为P2 代UVECs 单独培养，种植密度为5×104/cm2，用兔UVECs 培养基进行培养。每2 d 更换一次培养基，干预14 d，每天镜下观察细胞形态及大体改变 预血管化细胞膜片苏木精-伊红染色 将干预3，7，14 d 的实验组、对照组细胞经PBS 漂洗，进行苏木精-伊红染?预血管化细胞膜片CD31 免疫组化染色 收集干预14 d的实验组、对照组细胞进行固定，细胞通透、封闭非特异性蛋白，加入鼠抗兔CD31 一抗工作液，4 ℃孵育过夜，次日倒掉一抗工作液，滴加羊抗鼠IgG 二抗工作液，室温孵育30 min，DAB 显色，复染，脱水，透明，封固 预血管化细胞膜片RT-PCR 检测 获得干预3，7，14 d的实验组、对照组细胞，进行细胞总RNA 提取，反转录成cDNA，RT-PCR 检测血管形成相关因子mRNA 表达。PCR 引物：根据NCBI GenBank 中兔GADPH、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管生成素1、血管生成素2设计相应的引物核酸序列，见表1。操作步骤如1.4.4。表1 ｜血管形成相关基因引物序列Table 1 ｜Primer sequence of angiogenesis-related genes表注：上述引物由TaKaRa 公司协助设计合成，GAPDH 为内参；所有引物使用时短暂离心，加入无核酶水稀释至终浓度为10 μmol/L，4 ℃保存备用引物名称 碱基序列(5’→3’) 长度(bp)GAPDH forward TGA CGA CAT CAA GAA GGT GGT G 121 GAPDH reverse GAA GGT GGA GGA GTG GGT GTC血管内皮生长因子 forward GCA ATG ATG AAA GCC TGG AGT G 188血管内皮生长因子reverse CTT GCC CTT TCC TCG AAC TGA T碱性成纤维细胞生长因子forward GAG AAG AGC GACC CAC ACA TC 118碱性成纤维细胞生长因子reverse CCA GCA GTC TTC CAT CTT CCT T血管生成素1 forward TGT GCC CTC ATG CTT ACA GG 101血管生成素1 reverse TTC AGT TTG CCG TGG TTT TG血管生成素2 forward TAA GAG ACT GGG AAG GGA ATG AAG 131血管生成素2 reverse TTG GCT GAT GCT GCT TAT TTT G1.5 主要观察指标 预血管化细胞膜片镜下改变、组织学改变、免疫组化染色及血管形成相关因子表达水平 统计学分析 用SPSS 22.0 软件进行数据分析，实验数据采用±s方式表示，两组数据之间的比较采用独立样本t检验，P＜ 0.05 表示数据有显著性意义。2 结果 BMSCs 的形态及鉴定 细胞贴壁生长，呈梭形、纺锤形，平行排列或旋涡状生长，见图1。BMSCs 表面高表达CD90(97.80%)、CD44(95.27)%， 低 表 达CD34(1.01%)、CD45(0.90%)，见图2，符合间充质干细胞免疫表型。经成骨细胞诱导，茜素红染色可见钙颗粒染成红色，见图3A；未经诱导的细胞染色结果为阴性，见图3B。成脂肪细胞诱导，油红O 染色可见脂滴染成红色，见图3C；未经诱导的细胞染色结果为阴性，见图3D。由此可知，经全骨髓贴壁法分离培养的细胞具有贴壁特性，符合间充质干细胞免疫表型，具有多向分化潜能，符合间充质干细胞特征表现 干细胞膜片镜下观 经抗坏血酸作用后BMSCs 密度不断增加，细胞间隙不明，细胞呈梭状，重叠生长细胞密度不断增加，培养14 d 后细胞密度进一步扩大，细胞间隙消失、重叠生长，形态难以辨认，使用无菌镊机械分离细胞膜片，细胞膜片能够与培养皿底部完全分离，大体观察为半透明膜状细胞膜片；无抗坏血酸干预的BMSCs 增殖速度相对慢，细胞密度达到100%时细胞出现接触抑制现象，培养14 d 未见膜片样结构形成，见?干细胞膜片多向分化能力鉴定 干细胞膜片经成骨诱导分化培养基，培养过程中光镜下观察可见钙颗粒析出，经茜素红染液染色可见钙颗粒染成红色；未经诱导的细胞膜片细胞形态未见明显变化，茜素红染色阴性。细胞膜片经成脂诱导分化培养基干预，培养过程中倒置显微镜下观察可见胞浆内脂滴不断增大、变圆，油红O 染液染色可见脂滴染成红色；未经诱导分化的细胞膜片细胞形态未经明显改变，油红O 染色阴性，见图5。由此可见，BMSCs 经抗坏血酸处理形成细胞膜片后仍保留分化能?干细胞膜片细胞外基质相关检测 苏木精-伊红染色显示，干细胞膜片中的BMSCs 呈复层生长，细胞之间紧密连接，并分泌丰富的细胞外基质，见图6A。干细胞膜片组BMSCs Ⅰ型胶原及纤维连接蛋白mRNA 表达高于对照组(P＜0.05)，见?兔UVECs 镜下观 兔UVECs P0 代细胞贴壁生长，细胞为多角形，单层，当细胞汇合、融合时排列呈“铺路石”样，当细胞密度达约80%时按照1 ∶3 比例进行传代培养，传代细胞约30 min 开始贴壁，细胞呈集落生长，形态未见明显改变，增殖速度快，约2 d 即可进行传代，见?预血管化细胞膜片形态学观察 UVECs 与干细胞膜片共培养，UVECs 能够贴附于膜片上生长，每天镜下观察可看见细胞变化，3 d 后可见细胞发生迁移、重排，7 d 后可见脐静脉内皮细胞之间发生“联系”，形成网状结构，14 d 网状结构更加明显；UVECs 单独培养，细胞密度不断增加，形成细胞团，未见细胞发生重排、迁移形成网状结构，见?预血管化细胞膜片苏木精-伊红染色 苏木精-伊红染色细胞质及细胞外基质染成粉红色，细胞核染成蓝色。预血管化细胞膜片培养3 d 时可见细胞排列不均匀，7 d 时可见细胞条索状排列，14 d 见细胞呈网状结构；UVECs 在相同的培养基中单独培养，随着培养时间延长，3，7，14 d 可见细胞呈铺路石样堆积且密度不断增大，无条索状、网状结构形成，见?预血管化细胞膜片CD31 免疫组化染色 将干预14 d 的预血管化细胞膜片、UVECs 行CD31 免疫组化染色，UVECs染色阳性为细胞质呈棕色，胞核呈蓝黑色，实验组预血管化细胞膜片可见形成血管网状结构，而单独培养的兔UVECs 未见网状结构形成，见?预血管化细胞膜片血管形成相关因子表达 实验组干预3，7，14 d 的血管内皮生长因子mRNA 表达高于对照组，仅7 d 时组间比较差异有显著性意义(P＜ 0.05)，见图11A；实验组干预3，7 d 的碱性成纤维细胞生长因子mRNA 表达低于对照组(P＜ 0.05)，干预14 d 时高于对照组(P＜ 0.05)，见图11B；实验组干预3 d 时的血管生成素1 mRNA 表达低于对照组(P＜ 0.05)，7，14 d 时高于对照组(P＜ 0.05)，见见图11C；实验组干预3，7，14 d 的管生成素2 mRNA 表达高于对照组(P＜ 0.05)，见图11D。3 讨论 Discussion组织工程化组织实现血管化是目前组织工程技术的难题，血管化是组织移植后在宿主体内存活且维持功能的关键[29]。预血管化工程组织的方法已得到学者们的广泛关注，在体外将内皮细胞与其他类型的细胞共培养可获得毛细血管网[23，30-32]，将其植入体内后这些毛细血管网可以与宿主血管吻合，保证移植细胞的活性[30，33-34]。基于细胞膜片的众多优势，利用细胞膜片技术构建预血管化组织是目前的研究热点之一[35]。预血管化细胞膜片研究取得了欣喜的进展，使组织工程组织加速实现血管化成为可能，但是血管形成机制尚不清楚。此次实验初步探索预血管化细胞膜片血管形成相关因子的基因表达情况，利用RT-PCR 技术检测血管形成相关因子的基因表达，结果显示预血管化细胞膜片的相关基因表达比UVECs 单独培养高。研究表明，干细胞膜片产生的细胞外基质为UVECs 的增殖、迁移、重排和血管形成提供了适宜的微环境。细胞外基质为细胞膜片的骨架起到支撑作用，使得细胞膜片具有可塑性，同时是细胞与细胞之间、细胞基质之间信号传导的桥梁[36]。细胞外基质是由多种蛋白及多聚糖构成的网络结构，基本成分包括纤维性结构蛋白，如胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白等，还包括一些特殊蛋白，如生长因子、蛋白多糖、微基质蛋白[37-38]。实验使用RT-PCR 方法检测干细胞膜片Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白基因表达显著增高，为UVECs 迁移、重排及形成血管网络结构提供了良好的微环境。实验基于细胞膜片技术与UVECs 形成共培养体系，体外培养过程中可见UVECs 能够贴附在干细胞膜片上生长，发生细胞重排、迁移，BMSCs 之间发生“联系”形成网状结构。而将UVECs 单独培养的细胞密度不断增加，形成细胞团，未见形成网状结构。这些结果验证了将内皮细胞接种在干细胞膜片上能够获得预血管化细胞膜片，UVECs 受细胞膜片的影响发生迁移、重排、融合，逐渐形成类血管样网状结构。预血管化细胞膜片如何在体外形成血管网络结构的机制尚未明确。此次实验在基因水平检测预血管化细胞膜片血管形成相关因子表达出现显著变化，这些分子可能参与了新生血管形成，这些发现可能有助于理解其机制。分子调控在新生血管形成中发挥着重要作用。血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子被认为在血管形成过程中起着关键性作用[39]。血管内皮生长因子是目前所知最重要的促新生血管生成的细胞因子之一，被誉为新生血管形成的最初启动者[40]。血管内皮生长因子受体主要包括血管内皮生长因子受体1、血管内皮生长因子受体2、血管内皮生长因子受体3，其中血管内皮生长因子受体2 是血管内皮生长因子发挥生物学作用的最主要受体，主要存在于血管内皮细胞[41]。当血管内皮生长因子与特异性受体结合后产生诱导酪氨酸磷酸化，具有提高血管通透性、介导内皮细胞增生迁移等作用，引起内皮细胞增殖、出芽及血管形成[42]。碱性成纤维细胞生长因子是最早被发现的血管生长因子之一，在新生血管形成中具有重要作用，参与内皮细胞血管新生形成过程，能够刺激内皮细胞的增殖和迁移过程，促进血管生成[43]。血管生成素家族由Tie1、Tie2 两个受体及血管生成素1、血管生成素2、血管生成素3、血管生成素4 四个配体组成。血管生成素1 特异性与Tie2 受体结合，具有维持内皮细胞稳定、抗细胞凋亡、促进血管重建和成熟、调节血管生成等作用，并且能够与血管内皮生长因子协同促进血管形成成熟的血管结构[44]。血管生成素2 与主要与血管内皮生长因子协同发挥作用，当血管内皮生长因子不足时，血管生成素2 通过抑制血管生成素1的血管稳定作用引起血管内皮细胞凋亡，使血管发生退化，当血管内皮生长因子充足时两者可协同促进血管新生[45]。这些血管生长因子一般通过调控内皮细胞的增殖和迁移实现血管的再生。SASAGAWA 等[24]研究证实，预血管化细胞膜片分泌的血管生长因子蛋白可能参与了该膜片移植至体内后新生血管的形成。此次实验提示在预血管化细胞膜片体外形成血管化网络结构过程中，相关血管生长因子通过调控UVECs增殖、迁移、重排最终形成血管网络结构。综上所述，预血管化细胞膜片血管形成相关因子表达出现显著变化，这些分子可能参与了新生血管形成，这些发现可能有助于理解其机制，影响机制需要进一步深入研究。图 1 ｜兔骨髓间充质干细胞形态(×100)Figure 1 ｜Morphology of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (×100)图注：A 为原代细胞，贴壁生长，培养3 d 时散在分布，呈梭形或不规则形状；B-D分别为第1，2，3 代细胞，贴壁生长，细胞多呈纺锤形，呈平行排列或旋涡状生长图 2 ｜兔骨髓间充质干细胞表面标志物鉴定Figure 2 ｜Immunophenotype identification of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells图 3 ｜兔骨髓间充质干细胞多向分化能力鉴定(×100)Figure 3 ｜Identification of multipotent differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (×100)图注：A 为经成骨诱导分化培养基处理，茜素红染色可见细胞具有钙盐沉积；B 为未诱导组，茜素红染色为阴性；C 为经成脂诱导分化培养基处理，油红O 染色可见细胞内出现脂滴；D 为未诱导组，油红O 染色为阴性图 4 ｜干细胞膜片形态学观察(×100)Figure 4 ｜Morphology of stem cell sheets (×100)图注：A 为经抗坏血酸处理3 d 的骨髓间充质干细胞，细胞密度不断增加，细胞间隙不明，细胞呈梭状，重叠生长；B 为未经抗坏血酸处理3 d 的骨髓间充质干细胞，细胞密度增加幅度小，细胞间密切接触，细胞体积增大；C 为经抗坏血酸处理14 d 的骨髓间充质干细胞，细胞间隙消失、重叠生长，形态难以辨认；D 为未经抗坏血酸处理14 d的骨髓间充质干细胞，细胞单层生长，密切接触，细胞变大、变圆；E 为经抗坏血酸处理14 d 后用无菌镊收集细胞膜片，形成膜片样结构；F 为未经抗坏血酸处理未形成膜片样结构图 5 ｜干细胞膜片多向分化能力鉴定(×100)Figure 5 ｜Identification of multipotent differentiation of stem cell sheets (×100)图注：A 为经成骨培养基诱导分化的干细胞膜片，茜素红染色可见细胞具有钙盐沉积；B 为未诱导分化的干细胞膜片，茜素红染色阴性；C 为经成脂培养基诱导分化的干细胞膜片，油红O 染色可见细胞内脂滴染成红色；D为未诱导分化的干细胞膜片，油红O 染色阴性图6 ｜干细胞膜片细胞外基质相关检测Figure 6 ｜Detection of extracellular matrix of stem cell sheet图注：A 为干细胞膜片苏木精-伊红染色，细胞质及细胞外基质染成粉红色，细胞核染成蓝色，细胞复层生长，可见大量细胞外基质(×200)；B 为干细胞膜片与骨髓间充质干细胞细胞外基质Ⅰ型胶原及纤维连接蛋白mRNA 表达，aP＜ 0.05图7 ｜兔脐静脉内皮细胞形态学(×100)Figure 7 ｜Morphological of rabbit umbilical vein endothelial cells (×100)图注：A-C 分别为兔脐静脉内皮细胞P0、P1、P2 代，细胞贴壁生长，为多角形，单层，当细胞汇合、融合时排列呈“铺路石”样图8 ｜预血管化细胞膜片与脐静脉内皮细胞形态学观察(×100)Figure 8 ｜Morphology of prevascularized cell sheet group and rabbitumbilical vein endothelial cells group (×100)图注：A1-A3 为预血管化细胞膜片干预3，7，14 d，3 d 时预血管化细胞膜片中的脐静脉内皮细胞发生迁移、重排，7 d 可见细胞排列成条索状结构(箭头示)，14 d 时形成网状结构；B1-B3 为脐静脉内皮细胞单独培养3，7，14 d，随着培养时间的延长，脐静脉内皮细胞单独培养组细胞密度不断增加，形成细胞团，未形成网状结构图9 ｜预血管化细胞膜片与脐静脉内皮细胞苏木精-伊红染色(×200)Figure 9 ｜Hematoxylin-eosin staining of prevascularized cell sheet group and rabbit umbilical vein endothelial cells group (×200)图注：A1-A3 为预血管化细胞膜片干预3，7，14 d，3 d 时可见细胞排列不均匀，7 d 时可见细胞条索状排列(箭头示)，14 d 见细胞呈网状结构；B1-B3 为脐静脉内皮细胞单独培养3，7，14 d，随着培养时间延长，细胞密度不断增加，形成细胞团，未见条索状、网状结构形成图10 ｜预血管化细胞膜片与脐静脉内皮细胞CD31 免疫组化(×200)Figure 10 ｜ CD31 immunohistochemistry of prevascularized cell sheet and umbilical vein endothelial cells (×200)图注：A 为预血管化细胞膜片，可见形成血管网状结构；B 为单独培养的脐静脉内皮细胞，未见形成条索状、网状结构图11 ｜预血管化细胞膜片与脐静脉内皮细胞血管形成相关基因mRNA表达Figure 11 ｜mRNA expression of angiogenesis-related genes of prevascularized cell sheet and umbilical vein endothelial cells图注：A-D 分别为血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管生成素1 与血管生成素2 mRNA 表达； PVCS 为预血管化细胞膜片，RUVECs 为兔脐静脉内皮细胞。aP＜ 0.05致谢：感谢“国家自然科学基金、广东省自然科学基金”的经费支持，感谢广东省人民医院医学研究中心实验室及工作人员提供支持和帮助。作者贡献：实验设计为第一作者和通讯作者，实施为全部作者，评估及审校为通讯作者。经费支持：该文章接受了“国家自然科学基金项目()、广东省自然科学基金(2016A0)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。机构伦理问题：所有动物实验均按照广东省人民医院(广东省医学科学院)医学伦理研究委员会的要求操作(粤医科伦理A )。写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3 次查重。文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。生物统计学声明：该文统计学方法已经广东省人民医院生物统计学专家审核。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明：这是一篇开放获取文章，根据《知识共享许可协议》“署名-非商业性使用-相同方式共享4.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。4 参考文献 References[1] VACANTI JP. 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文章来源：《冶金与材料》 网址: http://www.yjyclzz.cn/qikandaodu/2021/0203/732.html